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脂環酸芽孢桿菌抗原制備

日期:2018/3/26 11:52:02 點擊次數 2029 發布單位:天義生物谷  錄入:李清

摘要:采用已建立的間接 ELISA 法分別測定 3F7 和 9C4 各吸收峰的純化產物,并與純化前的腹水、50%飽 和(NH4)2SO4 沉淀和 45%飽 和 (NH4)2SO4 沉淀的蛋白效價進行比較。將純化后腹水中 McAb 進行親和常數的測定。

免疫用抗原制備:參考文獻的方法培養 A. acidoterrestris (ATCC49025),重復洗滌 2 次后,用生理鹽水將該菌的濃度調整到 109 CFU/mL。

包被用抗原制備:取部分洗脫好的菌液用超聲波粉碎儀進行裂解。以 20 kHz 頻率、150 W 的功率在冰浴中將細菌細胞破碎,每 6 s 間隔 4 s,總共時間為 30 min。裂解后將液體 3 000 r/min 離心 10 min,將上清與沉淀分別用 Eppendorf 管進行分裝,存于−20 °C。

篩選方法采用間接 ELISA,用方陣滴度法確定抗原包被濃度和酶稀釋度。抗原分別做 1:1 000、 1:2 000、1:4 000 的稀釋;酶標分別做 1:20 000、 1:40 000 的稀釋;免疫小鼠多抗血清用樣品稀釋液從 40×起倍比稀釋;HRP 標記的羊抗小鼠 IgG,用酶稀釋液分別做 1:20 000、1:40 000 稀釋;設陰性和空白對照;以 450 nm 波長,以空白對照調零,讀記各孔光密度值(OD),凡P/N>2為陽性結果(P/N= 待測孔 OD 值/陰性對照孔 OD 值)。

取 5 只 6−8 周齡體重 18 g 左右雌性的健康 BALB/c 小鼠,免疫前 7 天卡介苗致敏小鼠 (0.1 mL/每只)。每次免疫間隔 3 周,都較前一次免疫劑量加倍,共 3 次。于第 3 次免疫 7 d 后以間接ELISA 法檢測小鼠抗體效價,取效價最高的小鼠脾臟進行細胞融合。確定的抗原包被濃度包被酶標板,將免疫小鼠全血按照 100×、200×、 400×−51 200×稀釋,即倍比稀釋的方法進行間接 ELISA 法檢測。

對凍存的骨髓瘤細胞(SP2/0)進行復蘇,用含 20%胎牛血清的 DMEM 完全培養液進行傳代培養,且加入 1% 8-氮鳥嘌呤進行處理,細胞處于對數生長期時即可用于細胞融合。制備飼養層細胞、免疫鼠脾細胞懸液,與骨髓瘤細胞進行細胞融合。

當融合細胞覆蓋孔底 20%−30%時,用間接 ELISA 法對細胞培養上清進行檢測,對挑選出的陽性孔及時采用有限稀釋法進行克隆。每次克隆后第 9 天左右,對克隆過的細胞上清用 ELISA 進行檢測,對所得的 OD450和對應的克隆數進行評價。選擇克隆數少、OD450 高的陽性孔,將其再次克隆。經 3−4 次克隆,直到陽性率 100%。將細胞株轉入 24 孔細胞培養板中繼續生長,待其適應后再轉入細胞瓶中。細胞數量足夠多時收集細胞進行小鼠腹水的制備。

取 8−10 周齡 BALB/c 小鼠,每只小鼠腹腔注射 0.5 mL高壓滅菌后的液體石蠟。7 d 后腹腔注入 1×106 −5×106 個雜交瘤細胞。小鼠腹部明顯膨大時,無菌操作收集腹水,1 000 r/min 離心10 min 收集中間層液體即為單克隆抗體,−20 °C 凍存備用。離心沉淀物用生理鹽水懸浮后按 1×106 −5×106 個細胞/只注射小鼠,繼續進行腹水的擴大化生產,將傳代過程中生長良好的細胞移入2 mL凍存管于液氮罐中凍存。

用間接 ELISA 方法對單克隆抗體細胞培養液上清和腹水進行效價測定,亞類鑒定采用 Sigma 公司的免疫球蛋白標準亞類鑒定試劑盒進行鑒定,雜交瘤細胞的染色體鑒定按照文獻進行。測定雜交瘤細胞在第1次到第4次克隆的 OD450。同時測定小鼠第 1、 2、3、4 代腹水的效價,并將這些結果進行比較。

用 ELISA 疊加試驗進行抗原位點分析(腹水和細胞上清),在確定各 McAb 飽和值的基礎上,在最適菌體抗原包被的酶標板內分別加入一種飽和濃度 McAb1 (100 μL/孔),37 °C 作用 30 min,洗滌 4 次后加入另一種飽和濃度的 McAb2 (100 μL/孔),同樣孵育洗滌;加入 1:1 000 稀釋的羊抗小鼠 IgG-HRP (50 μL/孔),同樣孵育洗滌;加入 TMB 底物溶液(100 μL/孔)顯色 10 min,2 mol/L H2SO4 終止反應,測定 OD450 值,計算疊加率(AI)。按如下公式計算:AI=[2×A(1+2)÷(A1+A2)−1]×100%。公式中: A1為 McAb1 的 OD450值;A2為 McAb2 的 OD450值; A(1+2)為 McAb1 疊加 McAb2 的 OD450值。AI >50% 說明被測的兩株單抗的抗原結合位點不同;AI<50% 說明被測的兩株單抗抗原結合位點相同;且 AI 值越大,抗原位點重疊的可能性越小。

 
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