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研究紫草素抑制白色念珠菌的材料和方法

日期:2018/11/25 15:02:33 點擊次數 1193 發布單位:天義生物谷  錄入:李清

1 材料和方法


1.1 材料


1.1.1 菌種: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231),購自中國醫學菌種保藏中心。


1.1.2 培養基與試劑: 沙堡葡萄糖瓊脂固體培養基(SDA)、RPM-1640液體培養基和酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(YEPD);蛋黃培養基;紫草素標準品購于成都曼斯特股份有限公司。


1.1.3 主要實驗儀器設備: 酶標儀(Thermo MULTISKAN ASCENT);PCR儀(英國TTECHNE-512型);實時熒光定量PCR儀(日本TAKARATP800);電泳凝膠定量分析系統(Bio-Rad公司,Version 3.1);掃描電鏡(KYKY-1000B);激光共聚焦顯微鏡(Zeizz LSM 710,German)。


1.2 紫草素對白色念珠菌的抑制作用測定


將200 μL培養至對數期的白色念珠菌的菌懸液(106 CFU/mL)分別加入96孔板中,再加入20μL不同濃度的紫草素藥液,使其終濃度分別為64、32、16、8、4μg/mL,37℃培養24h后于595 nm處測定吸光值。以不加藥物組為空白對照。實驗重復3次,取平均值。其中,紫草素對白色念珠菌的最低抑菌濃度(MIC)值為菌體的OD值下降80%以上的最低藥物濃度。從大于MIC的各孔中分別取10μL菌懸液涂布于SDA固體培養基上,37℃培養48h后觀察菌體生長情況,最低殺菌濃度(MFC)為平板上沒有菌體生長的最低藥物濃度。


1.3 紫草素對白色念珠菌細胞膜滲透性的影響


將培養至對數期的菌懸液按2%接種量接種于20mL RPM-1640液體培養基中,以150r/min、30℃恒溫培養16h后,離心棄上清液,用PBS洗滌菌體2次,制成適當濃度的白色念珠菌菌懸液,分別向其中加入濃度為MIC和2MIC的紫草素繼續培養12h,每隔2h分別取樣液4mL,4000r/min離心10min棄沉淀,用紫外分光光度計于260nm下測定上清液中DNA和RNA等大分子物質的變化。以不加藥為空白對照組,實驗重復3次,取平均值。


1.4 紫草素對白色念珠菌形態的影響


將培養至對數期的白色念珠菌菌懸液(107 CFU/mL)接種于含紫草素終濃度為MIC的YEPD液體培養基中,150r/min、30℃振蕩培養。于6h和16h分別取1mL菌懸液,3000r/min離心5min后棄上清。再加入0.5mL PBS緩沖液和0.5mL 2.5%的戊二醛,4℃冰箱固定過夜。次日用PBS緩沖液沖洗2次,50%、80%、100%乙醇依次脫水1次,每次15min,100%乙醇浸沒的電鏡樣品置4℃冰箱中降溫10min后,放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的樣品溫度升至室溫后取出,噴金鍍膜,使用掃描電鏡觀察照相,以不加藥組為空白對照,實驗重復3次。


1.5 紫草素對白色念珠菌細胞內鈣離子濃度的影響


將2mL RPM-1640培養基及300μL培養至對數期的菌懸液(106CFU/mL)分別加入6孔板中,每孔內分別放一片無菌蓋玻片,37℃培養4h后,以加入300μL濃度為MIC的紫草素的孔為實驗組,加入300μL去離子水的孔為空白對照組,37℃下繼續培養16h。然后吸出每孔中的液體,用PBS緩沖液洗滌2次。陰干后于避光環境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的鈣離子熒光探針(Fluo-3AM),于37℃培養箱中孵育45min進行探針裝載。吸出剩余的熒光探針染液并用PBS緩沖液沖洗,置于37℃培養箱中繼續孵育15min,以確保Fluo-3AM完全轉變為Fluo-3。取出蓋玻片,用10μL抗熒光淬滅劑進行封片后,利用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度,并按照公式(1)計算鈣離子濃度([Ca2+])變化百分率。實驗重復3次。




1.6 紫草素對白色念珠菌分泌胞外磷脂酶(phosphlipase,PL)的影響


制備10μL含紫草素終濃度為1/2MIC和MIC的菌懸液(106 CFU/mL)并用移液槍接種于卵黃培養基上,以加等量PBS的菌懸液為空白對照,于37℃下培養48h。待培養結束后,用刻度尺分別測量平板上的菌落直徑和沉淀圈直徑,每組實驗重復3次,取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示,PZ值按下列公式計算。PZ值=菌落直徑/總直徑。總直徑=菌落直徑+菌落周圍沉淀圈的直徑。PZ=1,表示無磷脂酶活性;PZ值<1,表示有磷脂酶活性,且PZ值越大,磷脂酶的活性越弱。


1.7 紫草素對白色念珠菌PLB1和PLB2相對表達量的影響


1.7.1 白色念珠菌PLB1和PLB2基因的檢測: 提取模板DNA,根據GenBank中已發布的白色念珠菌的基因序列,利用Primer 5.0軟件及參考文獻設計磷脂酶相關基因PLB1和PLB2的上下游引物,瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。PCR擴增條件為94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,30個循環;72℃ 10min。


1.7.2 紫草素對白色念珠菌PLB1和PLB2相對表達量的影響: 將培養至對數期的菌懸液接種到含紫草素終濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培養基中,30℃、150 r/min培養16h后,采用Trizol法提取RNA,用微量核酸測量儀進行RNA濃度的定量。采用2步法反轉合成模板cDNA,根據設計合成RT-PCR引物進行擴增。以18SrRNA為內參基因,以不加藥物組為空白對照。待反應結束后分析RT-PCR的擴增曲線和融解曲線,并計算PLB1和PLB2基因的相對表達量。


1.8 統計學方法


采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3統計軟件進行分析,數值用均數±標準差(x±s)表示。予以卡方檢驗和t檢驗。以P<0.05為具有統計學意義。

 
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